1 Введение
Хроматомасс-спектрометрия – метод анализа смесей веществ, основанный на комбинации двух самостоятельных методов – хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью хроматографии происходит разделение смеси на компоненты, с помощью масс-спектрометрии – идентификация вещества, определение его строения и количественный анализ.
Анализируемое вещество вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а его пары в смеси с газом-носителем поступают в капиллярную колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент по мере элюирования из колонки поступает в источник ионов МСД. Для присоединения МСД к хроматографу используется переходная линия, сквозь которую колонка проходит в МСД. В ней поддерживается достаточно высокая температура для того, чтобы высококипящие компоненты пробы не оседали на этом участке колонки.
В источнике ионов молекулы бомбардируются электронами с заданной энергией и в результате этого распадаются на ионы. Электроны излучает вольфрамовая нить, установленная в катоде. Для идентификации вещества по библиотеке спектров задают энергию электронов 70 эВ, т.к. библиотека состоит из спектров, полученных именно при такой энергии. В источнике ионов также поддерживается достаточно высокая температура для того, чтобы высококипящие компоненты пробы не оседали в нем.
Ионы из источника ионов поступают в квадрупольный масс-анализатор, который несколько раз в секунду формирует из них масс-спектр заданного диапазона. Диапазон масс-спектра выбирается в зависимости от предполагаемого вещества, и он может меняться несколько раз в течение анализа, по усмотрению пользователя.
На выходе масс-анализатора установлен детектор, который принимает и усиливает сигнал, сформированный масс-анализатором.
В результате формируется масс-спектр: график, на котором по оси абсцисс откладывается отношение массы иона к его заряду, или m/z (иногда сокращенно говорят просто о "массе" иона), а по оси ординат – интенсивность иона. Единицы обозначения оси абсцисс – атомные единицы массы (а.е.м.), а оси ординат – условные единицы, пропорциональных количеству ионов, полученных для данной массы.
Для примера на рисунке приведен спектр бензола из библиотеки спектров NIST:
Рисунок 1.1 – Пример спектра бензола из библиотеки NIST
Молекулярная масса бензола 78. Как видно, именно молекулярный ион имеет наибольшую интенсивность. Однако не для всех веществ данное условие выполняется.
Для нормального функционирования МСД, внутри него создается вакуум, для обеспечения достаточной длины пробега ионов. Для создания вакуума используются 2 насоса: турбомолекулярный насос (далее – ТМН) создает глубокий вакуум в МСД, а форвакуумный насос создает разрежение, достаточное для работы ТМН. Вместо ТМН допускается использование диффузионного насоса.
Рисунок 1.2 – Схема хромато-масс-спектрометра
Рисунок 1.3 – Принцип качественного анализа
2 Запись хроматограмм и количественный анализ
Результатом работы хромато-масс-спектрометра является последовательность спектров. Длительность сканирования одного спектра задается пользователем и может составлять от 0.015 до 300 секунд. Таким образом, график работы хромато-масс-спектрометра можно представить в координатах: Время-Высота-Масса/заряд.
Сумма интенсивностей всех ионов одного спектра, называется полный ионный ток. Вычислив полный ионный ток для каждого спектра, можно построить хроматограмму анализа по полному ионному току в координатах: Время-Высота. Такая хроматограмма строится по умолчанию при проведении анализа.
Также можно выбрать любую массу из записанного диапазона и построить хроматограмму только для нее, взяв из каждого спектра высоту выбранной массы.
Рисунок 2.1 – Схема записи МС-данных
Сигнал МСД пропорционален количеству поступившего в него вещества. Следовательно, его можно использовать для проведения количественного анализа. Для этого подходят как хроматограммы, построенные по полному ионному току, так и хроматограммы отдельных масс. Основное условие при выборе хроматограмм для анализа – чтобы пик определяемого вещества был на ней хорошо поделенным от соседних пиков и имел достаточное соотношение сигнал/шум. Количественный анализ по хроматограммам, полученным на МСД, проводится так же, как и по хроматограммам, записанным с других детекторов.
3 Идентификация веществ по их масс-спектрам
Имея хроматограмму, полученную на МСД, можно провести идентификацию компонентов, пики которых присутствуют на хроматограмме. Для этого выделяют масс-спектр вещества и поочередно сравнивают его со всеми спектрами из библиотеки. Находят наиболее похожий на него спектр и таким образом идентифицируют его. Идентификация проводится специализированной программой в автоматическом или ручном режиме и результатом ее работы является вероятность (до 100%), которая определяет степень схожести неизвестного и библиотечного спектров.
Чем больше вещества попадает в МСД, тем меньше влияние шумов на спектр, и тем чище полученный спектр. Следовательно, при идентификации наилучшие результаты будут давать спектры, составляющие вершину хроматографического пика, когда концентрация компонента в МСД максимальна.
При этом следует учесть, что при перегрузке детектора происходит искажение спектра. Идентификация вещества по искаженному спектру не даст достоверной информации и при идентификации такие спектры не рекомендуется использовать. Если хроматографический пик вместо вершины имеет плато, то, скорее всего, это плато состоит из перегруженных спектров. В этом случае для идентификации можно воспользоваться спектрами, составляющими передний или задний фронт пика.
Для повышения качества идентификации реализованы процедуры улучшения спектра: усреднение, вычитание фона и очистка.
3.1 Усреднение
При малом количестве анализируемого вещества спектры, образующие его пик, могут отличаться друг от друга благодаря статистической погрешности. В этом случае для получения более достоверной информации об истинном масс-спектре вещества рекомендуется усреднять несколько спектров, составляющих пик, и только после этого проводить идентификацию.
3.2 Вычитание фона
Типичны случаи, когда целевое вещество элюируется из колонки совместно с другим веществом, или когда колонка дает некоторый фон. В этих случаях произойдет наложение друг на друга спектров двух веществ или целевого вещества и фона колонки. Для получения более достоверной информации при идентификации, перед ее проведением следует очистить целевой спектр от наложений. Для этого используется процедура вычитания фона или другие процедуры очистки спектра. Данный алгоритм дает хорошие результаты как для пиков высокой, так и для пиков низкой интенсивности.
3.3 Очистка
Данный алгоритм дает хорошие результаты для пиков высокой интенсивности.
4 Селективность МСД
МСД обеспечивает селективность при правильно выбранной массе.
Повышение чувствительности
Следует учесть, что часто хроматограмма полного ионного тока обеспечивает худшую чувствительность, чем хроматограмма, построенная по максимальной массе спектра вещества. В качестве примера можно привести хроматограмму анализа, содержащего метилциклопентан:
Рисунок 4.1 – Полный ионный ток
Рисунок 4.2 – Хроматограмма по массе 56
Обработка неразделенных пиков
Рассмотрим пару неразделенных пиков: тетрахлорэтилен и бутилацетат:
Рисунок 4.3 – Количественный анализ по неразделённым пикам затруднён
Построив хроматограмму по массе 43, улучшим селективность для бутилацетата:
Рисунок 4.4 – Хроматограмма по массе 43
Построив хроматограмму по массам 129+166, улучшим селективность для тетрахлорэтилена:
Рисунок 4.5 – Хроматограмма по массам 129+166
Как видно, на этих хроматограммах пики не сливаются и количественный анализ возможен.
5 Поиск известного вещества
На хроматограмме с большим количеством пиков, используя повышенную селективность МСД, можно достаточно быстро найти интересующее нас вещество. Обратившись к библиотеке, выясняем, какая масса является максимальной в спектре интересующего нас компонента и строим ионограмму этой массы. Допустим, мы имеем хроматограмму по полному ионному току, содержащую более 30 пиков, на которой нам требуется найти толуол:
Рисунок 5.1 – Полный ионный ток
Из библиотечного спектра мы узнаем, что максимальной массой для толуола является 91 и строим ионограмму этой массы:
Рисунок 5.2 – Хроматограмма массы 91
Количество пиков для поиска сократилось до 5.
6 SIM (мониторинг отдельных ионов)
Использование SIM позволяет повысить селективность.
Для дальнейшего повышения селективности МСД используется режим SIM (мониторинг отдельных ионов). В этом режиме МСД формирует спектр в очень узком диапазоне масс. Если, например, мы хотим повысить селективность по бензолу, то выбираем диапазон спектра 78 а.е.м (это наиболее высокая масса в спектре бензола). При этом все остальные ионы игнорируются. В итоге чувствительность к бензолу значительно вырастает.
Ширину сканируемого спектра в этом режиме можно задавать от 0.01 до 10 а.е.м.